Expresión y purificación de GDNF para su microencapsulación y aplicación en la enfermedad de Parkinson = Expression and Purification of GDNF for its microencapsulation in drug delivery systems and application in Parkinson’s disease / Garbayo Atienza E., Blanco Prieto M., Aymerich M.S., Lanciego J. L

Este artículo se encuentra disponible en su edición impresa.

Bibliografía: p. 171

La enfermedad de Parkinosn (EP) es un proceso neurodegenerativo del sistema nervioso central que afecta a las neuronas
de dopamina de la sustancia negra, núcleo mesoencefálico del control motor. La perdida en el cerebro de este neurotransmisor vital causa los síntomas de la enfermedad. La EP afecta actualmente a 200 de cada 100.000 personas y a 2 de cada 100 entre los mayores de 60 años. En España hay unos 110.000 enfermos. Además, hoy por hoy no se conoce nada que pueda prevenir o curar la enfermedad, ni existe ninguna prueba de laboratorio que permita diagnosticarla. Recentiemente se ha demostrado que el GDNF, factor neurotrófico derivado de las células gliales, es capaz de proteger las neuronas dopaminérgicas e incluso inducir la regeneración del tejido dopaminérgico dañado in vivo.
El objetivo del trabajo fue diseñar y desarrolar un método de expresión y purificación de GDNF bioactivo para su posterior
microencapsulación y aplicación en la enfermedad de Parkison.
El sistema escogido para expresar el GDNF fue el sistema de células eucariotas de mamífero. El vector utilizado para la producción del GDNF en células eucariotas fue el pDEST26 (Tecnología Gateway de Invitrogen). Como sistema de expresión de
GDNF se utilizaron las líneas celulares eucariota BHK, 293 y COS 7. Estas células fueron cultivadas en medio D-MEM (Invitrogen) complementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y Penicilina/Streptomicina (100u/ml) (Invitrogen). La transfección se realizó con Lipofectamine Plus (Invitrogen). Se analizó la expresión de GDNF a nivel de mRNA mediante PCR y a nivel de proteína mediante Western Blot del medio condicionado. Los clones positivos se crecieron en botellas de cultivo de 850 cm2 (Corning) y se realizaron ciclos de recolección del medio. Cada ciclo fue analizado por SDS-PAGE y Western Blot.
Para evaluar la actividad de la proteína se ha desarrollado un ensayo de actividad en el que se demuestra la diferenciación
morfológica de células PC-12 inducida por GDNF. La presencia de los receptores GFRa1 y RET, necesarios para que el GDNF
ejerza su acción, fue determinada por PCR.
Las conclusiones obtenidas de este estudio son la obtención de GDNF recombinante a partir de un sistema de expresión en
células eucariotas, el desarrollo de un protocolo para su posterior purificación y la obtención de GDNF recombinante biológicamente activo.

Parkinson’s disease (PD) is a slowly progressive neurodegenerative disorder caused by decreased levels of dopamine in the
substantia nigra, brain region responsible for movement. The lack of dopamine is believe to be responsible of the symptoms
of PD. Parkinson’s affects 200 in 100000 people and 2 in every 100 persons over 60 years old. In Spain, there are about 110000 people with PD. There is no cure at this time, and there are no prevention techniques or therapies. Recently, it has been demonstrated that GDNF, a glial-derived neurotrophic factor is able to protect the dopaminergic neurons of the substancia nigra and it can also induce regeneration of injured neurons in the central nervous system in vivo.
The aim of this work was to develop a procedure for the expression and purification of bioactive GDNF in view of its microencapsulation for the treatment of PD.
The cDNA of the GDNF gene was cloned in the expression vector pDEST26 (Invitrogen) using the Gateway® Technology.
Several eukaryotic mammalian cell lines (BHK, COS-7, and 293) were stably transfected with the construction with Lipofectamine Plus (Invitrogen). In those clones in which the presence of the mRNA of the GDNF was confirmed by PCR studies, the expression of the recombinant protein in the serum free medium was analyzed by Western Blot studies. The highest GDNF-producing clone, obtained from the BHK cell line, was cultured in 850 cm2 roller bottles (Corning) alternating the presence or the absence of FBS in the medium every 24 hours, being collected only the serum free medium for the production of the recombinant GDNF. Each cycle protein expression was analyzed by SDS-PAGE and by Western Blot.
The secreted protein was purified by several chromatography steps. After each step of the purification procedure the fractions obtained were analyzed by SDS-PAGE, Western Blot and silver staining analysis. A neuronal differentiation PC-12 cell-based bioassay was also developed to confirm the biological activity of the purified recombinant protein. Previously, the presence of GFRa1 and RET, receptors required for GDNF activity were confirmed by PCR.
In conclusion, recombinant GDNF was produced in an eukaryotic mammalian cell line-based system. The protein purification procedure developed, allowed to obtain a highly purified recombinant GDNF. Furthermore, the recombinant protein is bioactive.